RNASCOPE®检测的实验原理是什么?

RNAscope®是一项新颖的用于检测位于完整细胞中目标RNA的原位杂交(In Situ Hybridization,ISH)检测技术。该技术以其能放大特异性信号而非噪音信号的专利探针设计方法,代表了RNA原位杂交(ISH)领域的一项重大进步。

RNAscope® In Situ Hybridization Assay Workflow

  • Step 1:

    透化

    通过RNAscope®预处理试剂盒处理载玻片上固定好的组织或细胞,以暴露目标RNA.

  • Step 2:

    杂交

    RNAscope®的20对针对靶基因设计的Z型目标探针与目标RNA杂交。

  • Step 3:

    信号放大

    RNAscope®检测试剂盒通过信号扩增序列与显色标记有序地互补结合从而扩大信号。

  • Step 4:

    可视信号形成

    在透视光学显微镜或者多光谱成像系统的观测下,每一个目标RNA分子以一个点状信号的形式呈现。

  • Step 5:

    量化分析

    显微镜下直接计数或者使用RNAscope® SpotStudio™ or HALO自动化图像分析软件对每一个细胞中的RNA单分子信号进行精确定量分析。

RNAscope® 探针设计与信号放大原理

为了能够显著提高RNA原位杂交ISH的信噪比,RNAscope®采用了一项已被证实的类似于荧光共振能量转移(FRET)的设计原理。两个独立的探针(Z形探针对)需要随机与目标序列互补结合,以实现信号放大。因为两个独立引物相互紧临同时互补结合到一个非目标序列的可能性非常之小,所以这种设计原理保证了对目标信号的特异性放大。

对于任意一个目标RNA序列,都有一组独特设计的20对Z形引物探针对只针对该目标序列具有互补杂交特异性,而不会结合到非目标片段上。

每一个Z形探针包含三个结构元素

Z型探针底部是一个18到25碱基长度的序列能够互补结合到目标RNA上。这个序列是基于目标序列的不同,以及独特的结合特征而进行的特异性设计。

Z型探针的中部是一个间隔序列,链接了探针的上下两端。

Z型探针的顶端是一个14碱基长度的尾部序列。因而一对Z形探针对的顶端序列组合成一段28个碱基长度的结合区以供信号放大前体序列的结合。

信号的放大由一系列的杂交组合串联事件最终实现。
  1. 20组Z形探针对互补结合到1KB长度的目标RNA上 。
  2. 信号放大前体序列结合到一对Z形探针顶端拼接而成的28个碱基长度的结合区域。
  3. 信号放大序列进一步结合到信号放大前体序列上的20个互补结合区。
  4. 带有荧光分子标记或者显色酶标记的引物结合到信号放大序列上的20个互补结合区。
RNAscope®探针设计与信号放大系统的优势
灵敏度

每三对Z形探针对就足以实现对一个RNA分子的检测。在RNA分子出现部分序列不能被有效暴露或者部分降解等情况下,20对Z形探针对的设计保障了足够强劲有效的检测RNA。

特异性

Z形探针对的设计屏蔽了背景噪音。单独一个Z形探针对即使结合上非目标序列也无法提供信号放大前体序列结合所需要的足够长度,从而防止了对于非特异信号的扩增,保障了特异性。

单分子量级的可视性与量化分析

此20x20x20x的引物设计与信号放大原理让单一RNA分子能够在标准的显微镜下以一个点状信号的方式可视化呈现。

能够探测到降解的RNA

得益于其相对短小的目标结合区域(Z形探针对的底端40到50个碱基长度),此Z形探针对的设计为检测到部分降解的RNA提供了保障。

This publication details the core principles behind RNAscope® Technology.
RNAscope: A Novel In Situ RNA Analysis Platform for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues.

Wang F,Flanagan J, Su N, Wang LC, Bui S, Nielson A, Wu X, Vo HT, Ma XJ, Luo Y (2012). J of Mol Diagnostics, 14(1):22-29.
PMID: 22166544. doi:10.1016/j.jmoldx.2011.08.002.

With RNAscope® VS Automated in situ hybridization and SpotStudio Software quantitative analysis, you can correlate your in situ mRNA stainingresults with RT-PCR data. This publication details this method.

Automated Quantitative RNA In Situ Hybridization for Resolution of Equivocal and Heterogeneous ERBB2 (HER2) Status in Invasive Breast Carcinoma.
Wang Z, Portier BP, Gruver AM, Bui S, Wang H, Su N, Vo HT, Ma XJ, Luo Y, Budd GT, Tubbs RR(2013). J of MolDiagnostics, 15(2):210-219.
PMID: 23305306. doi:10.1016/j.jmoldx.2012.10.003.

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